肿瘤的分子分型与个性化治疗

上海同济大学附属同济医院消化科、同济消化疾病研究所  郜恒骏

生物芯片技术是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的前沿、高新技术。该技术将高密度的核酸、蛋白质、组织、细胞等包被在硅片、玻片等固相支持物上，故主要分为基因芯片、蛋白芯片、组织芯片与细胞芯片等。通过设计不同的阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱研究、突变检测、多态性分析、分子标记物筛选等，为功能基因组的研究及医学诊断学的发展提供了强有力的工具，将会在新基因的发现、基因诊断、药物筛选等方面取得重大突破，为整个人类社会健康带来深刻而广泛的变革。

系统生物学（systems biology）与三P医学

过去的一百多年，肿瘤研究走进了这样一个误区：肿瘤一直被认为是一个器官的局部病变，直至今天一提到肿瘤，基础与临床研究者就会想到肿瘤细胞，对癌症的研究也变成了癌细胞的研究。事实是肿瘤并不是一堆癌细胞的堆积，癌细胞不是孤立存在的，而是有着严密结构的组织，包括间质、血管、淋巴细胞、免疫细胞等，癌细胞的研究不等于癌症的研究。可见，对癌症的研究也变成了癌细胞的研究显然不妥。随着基因组、功能基因组等各种组学的深入研究与高通量生物芯片、高通量RNAi等技术的迅猛发展以及能分析海量生物信息数据的高性能计算机问世，系统生物学（systems biology）应运而生。最新研究成果不断提示：肿瘤的发生除肿瘤细胞自身存在众多的基因表达改变外，它更是一个全身性疾病的局部反应，是机体作为一个生物系统的整体平衡失调的结果，即肿瘤是一个系统性疾病。其特征是局部细胞的不正常生长，但这是以全身改变为背景的。这是一个非常重要的问题：因为长期以来, 肿瘤诊治未能取得突破的很重要原因是我们对肿瘤的认识出现了问题，如果旧的观念仍然不改变，在很长的时间内，肿瘤治疗将很难达到根治。希望国内有更多从事肿瘤临床研究的医生能够一起反思并重视这个问题。系统生物学使得疾病的预测（Prediction）、预防（Prevention）或干预（Preemptive）、分子分型与个性化治疗（Personalized therapy）即所谓的三P医学以及分子水平早期诊断、预后评估等走到前台，具有重大的基础与临床研究价值。

个性化治疗（Personalized therapy）

临床上，对于不同个体（如均为成年人），患同样疾病，医生们常常给予他们同样治疗方案、药物、甚至剂量，事实上，其中有些患者对药物反应好、有些效果一般、另有一些甚至出现严重不良反应（ADR）。可见，即使患同样疾病，一种治疗方案、药物及其剂量并不适合所有患者。基因组、HapMap（SNP）与拷贝数变异（CNV）、功能基因组及其技术（如高通量生物芯片）快速发展与应用，使得我们清楚的认识到人与人之间存在的差异（可能达10-15%），正因为这些差异导致了人与人之间的千差万别，包括对疾病的不同易感性（即不同的患病风险）、对药物的不同反应（即不同的疗效与副作用）以及疾病的不同预后。这提示我们在临床上，对于不同个体（如均为成年人），即使患同样疾病，医生们应考虑给予他们不同样治疗方案、药物或剂量，即所谓的个性化治疗。

药物基因组学（Pharmacogenomics）与营养基因组学（Nutrigenomics）

近年来，肿瘤的诊治取得了长足的进展，但在不同病人间存在着显著的疗效和毒副作用的差异。除了环境等因素外，不同个体的基因组差异是造成疗效和毒副作用差异的主要因素。恶性肿瘤治疗方法的发展将很大程度取决于药物基因组学（Pharmacogenomics）的研究与应用。所谓药物基因组学是研究遗传因素对病人药物效应的影响，鉴定与药物疗效和毒性相关的基因改变或基因表达谱、单核苷酸多态性（SNP）或CNV，其最终目标是根据患者的遗传特征（即分子分型，Molecular  Classification）建立最优化的治疗方案与最合适的剂量，获得最高的疗效，而毒副作用却最小，使得“量体裁药”成为现实。药物基因组学将为我们从消化道肿瘤综合治疗由目前传统治疗模式过度到个性化指明了方向。此外，对肿瘤的防治更为超前的是个性化饮食（Personalized diet）预防或干预，即前NIH（国家健康研究所）主任Bernadine Healy博士所描述的：根据一个人出生后的基因型来确定她应该吃什么样食物，即所谓的营养基因组学（Nutrigenomics）。

   分子分型（Molecular  Classification）的方法与种类

   分子分型的方法与种类常见的归纳如下。DNA水平：检测单核苷酸多态性（SNP）或拷贝数变异(CNV)、DAN甲基化（DAN Methylation / Epigenomics），DNA序列分析（DNA Sequence），比较基因组杂交（CGH）、DNA芯片等；RNA水平：基因表达谱（Gene Expression Profiling，EGP）分析、MicroRNA，RNAi等；组织水平：基于组织或组织芯片（Tissue Microarray，TMA）的分子病理学。其他还有蛋白、抗体检测或蛋白芯片方法。目前热门的治疗领域还有分子靶向治疗（Molecular Targeted Therapy，MTT）。

    分子分型与个性化治疗

几种质子泵抑制剂(PPIs)由肝脏中CYP2C19所代谢。CYP2C19的基因型分为三种：homEM（homozygous extensive   metabolizer)，hetEM (heterozygous extensive metabolizer)和PM（poor metabolizer). 在这三种基因型中PPIs 的pharmacokinetics与pharmacodynamics均不同，治疗时血浆PPI与胃内pH 水平homEM组最低，而PM组最高。CYP2C19 的不同基因型影响基于PPIs 的疗效，如GERD、PU以及H.pylori根除治疗。CYP2C19基因型检测有助于个性化指导确定PPI以及 PPI为基础的治疗方案与治疗剂量。

    对27种经常导致严重不良反应的药物研究发现：其中59%至少存在1个药物代谢酶的基因变异而严重影响药物代谢，对照组的变异仅7-22%。基因变异影响药物代谢动力学是产生严重不良反应的重要原因。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）仍是目前肠道等恶性肿瘤的基本化疗药物之一，是许多含有新药的实验药物配伍的基本成分之一。5-FU疗效相关的基因检测已被列入卫生部临床检验目录中（http://www.moh.gov.cn/newshtml/19264.htm）。二氢嘧啶脱氢酶基因（dihydropyrimidine dehydrogenase gene，DPYD）多态性较高，已鉴定遗传变异有39多个。中国人中，最常见的缺陷等位基因是DPYD*9，频率为5-14％。该等位基因编码的DPD酶活性完全缺失，无法代谢5-FU，使用5-FU 时毒副作用会较大，甚至危及生命。5-FdUMP能与胸腺嘧啶合成酶（thymidylate synthase，TS）结合，影响dUMP与TS的结合。若TS表达增高，将降低5-FU 疗效，进而影响肿瘤患者5年生存率，TS高表达的结直肠癌患者比低表达者生存期短。胸腺嘧啶合成酶基因（TYMS）中影响其表达的遗传变异，是造成个体间5-FU疗效差异的主要原因之一。通过检测DPYD和TYMS等基因遗传变异，有助于提高5-FU疗效并降低毒副作用。

   服用依立替康（Irinotecan ，CPT-11）可治疗转移性结直肠癌、胃及食道癌。治疗前需要做UGT1A1基因检测，其遗传学检测已获美国FDA批准（Marsh S.  Mol Diag Ther, 2007, 11: 79-82.）。人尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸基转移酶（UDP glucuronosyltransferase 1 family， polypeptide A1，UGTIA1）能催化CPT-11的活性形式SN-38为无活性的代谢产物SN-38G，该基因表达差异可造成个体间SN-38G生成能力的差异。UGT1A1*28包含7个TA重复序列，是UGT1A1基因最常见的变异型，其频率在亚洲人中为15％。UGT1A1*28肿瘤患者体内UGTIA1酶缺乏，在应用CPT-11治疗时，体内SN-38聚集，引发腹泻或嗜中性白血球减少症。谷胱甘肽S-转移酶（glutathione-S-transferase，GST）能催化谷胱甘肽与铂类药物结合，使之失活并增加其水溶性，促使药物外排，因此与铂类药物的细胞内耐药相关。GSTP1基因第105位异亮氨酸残基突变成缬氨酸残基后，奥沙利铂/5-FU联合用药的生存率显著提高。在DNA结合物存在的情况下，X线交错互补修复基因1（x-ray repair cross-complementing group 1，XRCC1）的Arg399Gln改变了二磷酸腺苷核糖多聚酶（PARP）结合域的特性，降低了DNA修复能力。与纯合399Arg相比，携带399Gln患者接受奥沙利铂/5-FU治疗效果较差，生存期短。

   80%KIT酪氨酸激酶基因突变，最常见位点是外显子11，其他外显子9、13和17。5-7%存在PDGFRA突变，为外显子12和18。10-15%为野生型，无突变。DNA Sequence：可以检测GIST突变的位点，评估酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼（Gleevec）疗效，指导个性化治疗，外显子11突变，对甲磺酸伊马替尼客观反应率70%，400mg/d，增加剂量疗效无影响；外显子9突变，对甲磺酸伊马替尼客观反应率35%，800mg/d才能获得较高反应率。

检测宿主遗传易感性最重要的意义就在于研究疾病的发病机制。具体到研究H.pylori宿主遗传易感性的意义而言，其意义则是在以下两方面：一是机体在受到H.pylori 攻击时开始发生损伤，此过程中宿主遗传易感性起到怎样的重要作用；二是在由H.pylori诱发的慢性炎症过程中，胃生理机制被造成长期损害，而宿主遗传易感性在其中产生了如何重要的影响。明确宿主遗传易感性的另一个重要意义是能根据某些暴露因素（如微生物、化学、饮食、药物等）来预测临床结局。例如：通过确定宿主遗传易感性，对那些感染H.pylori后可能发生萎缩和低酸状态者，因为有遗传学筛查依据，这些个体就应当被列为需要提供根除H.pylori治疗的对象。我们构建了H.pylori感染宿主胃癌易感性基因联合检测芯片将有助了解不同的个体暴露于危险因素时，其发生各种不同临床结局的风险，判断胃癌高危个体和H.pylori根除对象，为胃十二指肠疾病，尤其是胃癌预测、预防、早期诊断和个性化治疗提供新思路。

自荷兰癌症研究所首先发现的与淋巴结阴性乳腺癌预后相关的76个基因表达谱，使鉴别不需要系统治疗的低复发风险原发性乳腺癌这一梦想有可能在不远的将来成为现实。大约70%的乳腺癌患者术后并不会发生转移，也就是说这70个左右的基因检测，决定有70%的患者是不需要术后辅助治疗的。美国FDA提准了这一检测，使得临床利用基因表达谱检测指导个性化治疗、预测预后成为现实。通过分析文献报道的对5-FU耐药的胃癌和结直肠癌的全基因组基因表达谱数据，发现胃癌和结直肠癌中与5-FU耐药相关的表达谱是一致的，提示不同肿瘤对5-FU具有相同的耐药机制。在胰腺癌方面，有研究分析了吉西他滨（gemcitabine）转运和代谢相关基因对胰腺癌细胞珠耐药形成过程中的表达水平的改变，发现hENT1 x dCK/RRM1 x RRM2基因表达比率随着吉西他滨耐药性的获得而逐步降低，因此这4个基因表达水平的比率与胰腺癌细胞珠获得性吉西他滨耐药相关，可能是胰腺癌吉西他滨疗效的预测指标。对吉西他滨敏感珠和耐药珠（KLM1-R）的研究发现，HSP27在KLM1-R中高表达，并且KLM1-R敲除HSP27后恢复了对吉西他滨的敏感性。在胰腺癌病人中，HSP27表达增高与吉西他滨较高的耐药性相关，提示HSP27表达检测可能用于胰腺癌吉西他滨的疗效预测。但这些研究结果有待于大样本量的临床试验验证。

   恶性肿瘤个体生物学行为的预测是临床医生的迫切需求，也是未来分子诊断病理学（Molecular Pathology）面临的挑战。基于组织与组织芯片技术的恶性肿瘤预测病理学指导个性化治疗、预测预后成为当今研究的热点。上海芯超生物承担了国家发改委生物芯片上海国家工程研究中心以及十五国家863《功能基因组与生物芯片》——组织生物样本库与组织芯片的重大项目。2年来，应用自主开发的芯超高通量组织芯片进行肿瘤预测等分子病理学研究发表的论著近50篇，其中有国际著名杂志《Journal of Clinical Oncology》（IF15.484）2篇、《Hepatology》（IF:10.7）5篇、《Cancer Res》（IF:7.672) 1篇、《Clinical Cancer Res》（IF:6.25）1篇、《Oncologist》 (IF: 4.876）1篇、《Cancer》（IF:4.632）2篇、《Autophagy》（IF:4.657）1篇、《J Cancer Res Clin Oncol》（IF:2.366）2篇等，影响因子已经超过100分。标志着芯超高通量组织芯片已经达到国际先进水平，奠定了中国组织芯片国际品牌的地位。应用肝癌组织芯片的合作研究发现，在乙肝所致的肝癌术后，P48基因表达的检测是决定术后是否应用INF-a治疗的重要标记物。TILs、Tregs对术后肝癌预后评估及个性化治疗措施的制定均有重要的指导作用。癌周组织中MCSF的高表达与肝癌术后预后不良密切相关。CK16与伴有淋巴结转移的肝癌的远期预后有关。

   分子分型与分子靶向治疗

   肿瘤发生、发展与一些重要的信号传导（Signal transduction）通路与血管生成（Angiogenesis）密切相关。抑制或阻断这些重要的靶点，能有效地抑制肿瘤的生长与转移。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）等酪氨酸激酶生长因子受体及其配体在消化道恶性肿瘤常常表达增高，导致有丝分裂信号通路异常地活化，引起细胞生长失控。这些受体的抗体和小分子酪氨酸激酶抑制剂均能阻断这些信号通路。分子靶向治疗的类型与常用药物：一种是抗EGFR药物(EGFR抑制剂:EGFRI)如Gefitinib(吉非替尼，易瑞沙Iressa)、Erlotinib（埃（厄）罗替尼—小分子单抗）、Cetuximab（西妥昔单抗，IMC-C225——大分子单抗）与Nimotuzumab（尼妥珠单抗，泰欣生——人源化抗EGFR大分子单抗 ）等。cetuximab是EGFR的单克隆抗体，与化疗或放疗联合应用时具有协同作用,具有毒副作用少、靶向性好等优点，广泛应用于消化道恶性肿瘤的治疗。近年来的研究显示，KRAS突变显著影响结直肠癌患者cetuximab疗效，KRAS突变者表现为对cetuximab耐药，生存期较差。因此，结合皮肤反应和KRAS突变，可以确认出预后较差的结直肠癌患者。另一种是抗血管生成药物如Bevacizumab（贝伐单抗，Avastin——选择性的抑制VEGF）、Endostar（恩度，重组人血管内皮抑素）与Thalidomide（沙利度胺，反应停）等。多靶点抑制如Sorafinib（索拉非尼，名多吉美），抑制Raf/MEK/ERK与VEGFR、PDGFR，Raf酶等多靶点抑制剂索拉非尼对晚期肝癌效果明显，开创了HCC分子靶向治疗新时代。当前，高通量RNAi技术的问世，可根据自己的研究思路与研究设计，一次性地同时干扰数十个、数百个基因，这一高通量基因功能的研究工具，将在诊断标记物与治疗靶点的筛选中发挥极其重要的作用。

   分子分型与个性化治疗基础研究值得重视的问题

   临床专家必要认真思考如何开展分子分型与个性化治疗的研究。首先，课题设计很重要，当今信息化、系统生物学研究时代，需要临床专家、技术专家、基础研究专家，甚至生物信息专家共同设计课题。接下来至关重要的是样本准备很重要，根据分子分型与个性化治疗的研究需要，制订标准化流程（SOP），并严格按照此SOP收集治疗前后的组织、血清、血浆、全血等样本以及相关重要的实验室数据与临床资料，这是研究至关重要的环节与源头，只有这样研究才能有广度与深度，结果才能具有重大的科学与应用价值，最终应用分子分型结果指导临床个性化治疗。至于药物基因组等研究技术，建议临床医院等研究单位应善于整合国家级生物芯片的研究中心，作为自己的共享平台，为我所用。最后值得重视的问题是，药物基因组学与生物芯片研究结果的分析需要临床专家与生物信息专家共同完成，科学地分析并从海量信息中挖掘有价值的数据是艰巨、但是更为重要的工作。